自2019年底新冠疫情爆發(fā)以來，海外疫情還在不斷持續(xù)和蔓延，國內(nèi)疫情偶有發(fā)生，多為境外輸入或與之相關。根據(jù)美國約翰斯·霍普金斯大學發(fā)布的新冠疫情最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)，截至2021年10月17日上午8點，全球累計新冠確診病例近2.4億例，累計死亡病例超過480萬例。

圖1 全球新冠疫情統(tǒng)計數(shù)據(jù)

（數(shù)據(jù)來源：https://coronavirus.jhu.edu/map.html）

新冠病毒是一種單鏈RNA病毒，核酸序列總長約30Kb（不同毒株，長度略有不同）。由于新冠病毒一直在不斷變異進化，世衛(wèi)組織根據(jù)病毒株發(fā)現(xiàn)時間的先后順序，依次使用希臘字母對其命名。如：Alpha(α)、Beta(β)、Gamma(γ)、Delta(δ)、Lambda(λ)等，目前，Delta和Lambda為主流毒株。

圖2 新冠病毒進化演變

（數(shù)據(jù)來源：https://nextstrain.org/ncov/gisaid/global）

至今，全球公開的新冠病毒序列已經(jīng)超過87萬條，當疫情爆發(fā)，第一時間破解病毒全基因組序列，持續(xù)監(jiān)測毒株變異，明確毒株分型，對鎖定傳染源、控制傳播途徑和疫苗研發(fā)等都至關重要。

目前，市面上多家公司推出了基于多重PCR擴增獲得新冠病毒基因組全長序列的檢測試劑盒產(chǎn)品，我們挑選了其中5款使用GenoLab M高通量基因測序平臺對其檢測性能進行評估。

圖3?技術路線

對不同試劑盒的RNA組樣本及RNA 拭子組樣本（Ct值17-38）的GenoLab M平臺測序結果進行測序質(zhì)量、基因組覆蓋度、100×覆蓋度比例等參數(shù)的分析對比，根據(jù)“100×覆蓋度比例≥90%”確定本次測試的檢測限。

結果表明：

注：RNA拭子組中Ct 34.25樣本的比對率為54.98%，其中98.08%的unmapped reads比對到人的參考序列上

表2 Genolab M測序數(shù)據(jù)分析

注：在計算基因組覆蓋度及100×覆蓋度比例時，由于Synthetic SARS-CoV-2 RNA質(zhì)控品是由6個RNA片段組成（斷點位置：5K、10K、15K、20K、25K），斷點區(qū)域的擴增效果差，因此導致覆蓋度比例會相應降低

通過以上對比可知，A、C-1、C-2、GM-LDT 試劑盒在低病毒載量樣本（~Ct 30）中均能較好的滿足“100×覆蓋度比例≥90%”。當存在人源RNA干擾時，B試劑盒RNA組與RNA拭子組樣本測試數(shù)據(jù)差異較大，可能人源RNA的存在對其試劑盒的性能有較大的影響。C-1試劑盒與C-2試劑盒的性能相當。

綜合比較各試劑盒RNA組和RNA拭子組Ct值的中值^[1]和檢測限值（Ct值26.5-35.93）測試數(shù)據(jù)的基因組覆蓋均一性，如下圖所示，C-1、C-2、GM-LDT 試劑盒的基因組覆蓋均一性優(yōu)于A試劑盒和B試劑盒。

圖4 基因組覆蓋均一性

如下表所示，A、C-1、C-2、GM-LDT試劑盒在中值組中的檢測靈敏度與陽性預測值均大于90%，在檢測限組，除A試劑盒外，C-1、C-2、GM-LDT 試劑盒的檢測靈敏度與陽性預測值均大于90%。相比之下，B試劑盒的檢測靈敏度與陽性預測值相對較差。

表3?靈敏度與陽性預測值

注：Synthetic SARS-CoV-2 RNA質(zhì)控品中含有30個陽性位點

基于A、B、C-1、C-2、GM-LDT 試劑盒的測序數(shù)據(jù)構建進化樹。結果如下圖所示，幾款試劑盒檢測的結果與Synthetic SARS-CoV-2 RNA質(zhì)控品能準確的聚類到一個分支，且C和GM-LDT結果與質(zhì)控品距離最近。

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綜合比較A、B、C-1、C-2、GM-LDT 試劑盒的檢測限值數(shù)據(jù)，其結果詳情如下：